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MTT廣泛用于檢測細(xì)胞生長，其原理是MTT可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結(jié)晶，而死細(xì)胞則無此活性。深紫色的formazan結(jié)晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度，并由此推測出細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。其原理如下：
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1．采用獨(dú)特的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。
2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復(fù)性好。
3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)微孔板檢測。
4．可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性測定等。
試劑盒組成：
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成分
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規(guī)格
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溶液A
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5ml
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溶液B
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50ml
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說明書
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1份
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儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運(yùn)輸和保存)，有效期一年。
使用方法：
下面操作是檢測細(xì)胞毒性的試驗(yàn)，其他應(yīng)用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗(yàn))，操作步驟可以以此為基礎(chǔ)稍作修改即可，故不再贅述。
㈠、接種細(xì)胞
1．按常規(guī)胰酶消化法消化匯合的單層細(xì)胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。
2．200g離心5分鐘收集細(xì)胞沉淀。
3．用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸浮液并計(jì)數(shù)。
4．將細(xì)胞稀釋到2.5×103個(gè)/mL～5×10個(gè)/mL之間(需要根據(jù)細(xì)胞的生長速度決定)，如果不知道生長數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個(gè)/mL。
5．將足夠量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個(gè)96孔板的MTT檢測需要約20mL的細(xì)胞懸液。
6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細(xì)胞懸液(對正常細(xì)胞)。如果是腫瘤細(xì)胞，則加入100μL腫瘤細(xì)胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細(xì)胞加在孔的正中，否則細(xì)胞會(huì)聚集在孔的角落處，影響試驗(yàn)。
7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細(xì)胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對照(用于測OD時(shí)調(diào)零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應(yīng)對第11 列反應(yīng)的影響。
8．按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長期。
㈡、藥物處理
9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個(gè)待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預(yù)試驗(yàn)確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動(dòng)細(xì)胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細(xì)胞-藥物的對照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個(gè)濃度梯度的待測藥物，每列加入一個(gè)濃度的藥物。
13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時(shí)間，此段時(shí)間即為藥物處理細(xì)胞的時(shí)間，由用戶自己決定。
14．處理結(jié)束后去除第2 到第11列(共10列，均含細(xì)胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。
15．每天換培養(yǎng)使細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增2-3倍(所需時(shí)間隨細(xì)胞不同而不同)。
㈢、存活細(xì)胞計(jì)數(shù)
16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時(shí)。注意：溶液A在低溫情況下會(huì)凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。
17．小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會(huì)影響光吸收，最好盡可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結(jié)晶物充分溶解。
19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。
注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對照)調(diào)零。
20．計(jì)數(shù)同樣處理的各次重復(fù)的平均值。
21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大，一般需將其轉(zhuǎn)化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計(jì)算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測生長曲線，則以時(shí)間為橫軸。正常生長曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進(jìn)作用的則斜率加大。
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