| 產(chǎn)品編號 | C6207 |
| 英文名稱 | Animal Cell/Tissue Genome Extraction Kit |
| 中文名稱 | 動物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒 |
| 別 名 | 超強(qiáng)通用型基因組DNA提取試劑盒; |
| 克 隆 號 | |
| CAS | |
| 理論分子量 | kDa |
| 檢測分子量 | |
| 保存條件 | 室溫干燥可保存一年。 |
| 注意事項(xiàng) | This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications. |
| 產(chǎn)品介紹 |
產(chǎn)品簡介 本試劑盒適合于從新鮮或冷凍的動物組織（比如鼠尾、肝臟等），細(xì)胞，血液，細(xì)菌等多種樣品中提取高純度總DNA。本品可純化獲得分子量最大為50kb的DNA片段，純化過程不需要使用苯酚或氯仿等有毒溶劑，無需乙醇沉淀。本試劑盒采用優(yōu)化的緩沖體系使裂解液中的DNA高效特異的結(jié)合到硅基質(zhì)離心吸附柱上，PCR和其他酶促反應(yīng)的抑制劑可通過兩步洗滌步驟被有效去除，最后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可得到高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切，PCR，Real-Time PCR，文庫構(gòu)建，Southern Blot，分子標(biāo)記等下游實(shí)驗(yàn)。 產(chǎn)品組份 Buffer GTL: 12 ml (50T) Buffer GL: 12 ml (50T) Buffer GW1（concentrate）: 13 ml (50T) Buffer GW2（concentrate）: 15 ml (50T) Buffer GE: 7 ml (50T) Proteinase K** : 1 ml (50T) Spin Columns DM with Collection Tubes: 50個(gè) (50T) ** Proteinase K（蛋白酶K）：-20℃保存，開蓋后防止空氣及槍頭污染，如果出現(xiàn)絮狀 物，是因?yàn)槿芙饩彌_液中的鈣離子在磷酸鹽中可能會產(chǎn)生不溶解性沉淀，離心取上清，不影響使用效果。 自備試劑 無水乙醇；Enzymatic Lysis Buffer（提取革蘭氏陽性菌基因組DNA時(shí)須準(zhǔn)備）。 Enzymatic Lysis Buffer 配方：20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2％Triton X-100；終濃度為20mg/ml的Lysozyme（溶菌酶）。 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng) 1. 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會導(dǎo)致提取DNA片段較小且提取量下降。 2. 如果提取次生代謝產(chǎn)物大量積累或細(xì)胞壁厚的細(xì)菌培養(yǎng)物的基因組，建議在對數(shù)生長期早期收集樣品。 3. 第一次使用前應(yīng)按試劑瓶標(biāo)簽的說明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇。 4. 使用前請檢查Buffer GTL和Buffer GL是否出現(xiàn)結(jié)晶或沉淀，如有結(jié)晶或沉淀，請將Buffer GL和Buffer GTL于56?C水浴重新溶解。 5. 如果下游實(shí)驗(yàn)對RNA污染比較敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A（100mg/ml），RNase A 本試劑盒并未提供，可單獨(dú)訂購。 操作步驟 血液及細(xì)胞樣本基因組提取 1. 材料處理 a) 如果提取材料為哺乳動物抗凝血液（無核紅細(xì)胞），可直接向50-200μl新鮮或冷凍的抗凝血液樣品中加入Buffer GTL補(bǔ)足至200μl。 b) 如果提取材料為禽類，鳥類，兩棲類或更低級生物的抗凝血液，其紅細(xì)胞為有核細(xì)胞，取5-10μl新鮮或冷凍的抗凝血液樣品，加入Buffer GTL補(bǔ)足至200μl。 c) 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液（最大提取量為5x106個(gè)細(xì)胞），2000 rpm（400xg）離心5分鐘，棄盡上清，加200μl GTL，振蕩至樣品徹底懸浮。 注意：如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入4μl濃度為100mg/ml的RNase A 溶液，渦旋15秒，室溫放置2分鐘。 2. 加入20μl Proteinase K 溶液,混勻。 3. 加入200μl Buffer GL，渦旋振蕩充分混勻，56?C水浴10分鐘。 4. 短暫離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加入200μl無水乙醇，渦旋振蕩充分混勻，短暫離心。 注意： 1）加入Buffer GL和無水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。 2）加入Buffer GL和無水乙醇后可能會產(chǎn)生白色沉淀，不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。一些組織在加入BufferGL和無水乙醇后可能形成溶膠狀產(chǎn)物，此時(shí)推薦進(jìn)行劇烈震蕩或渦旋處理。 5. 上一個(gè)步驟中所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm（約13,400 xg） 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 6. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 7. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 注意：如需進(jìn)一步提高DNA純度，可重復(fù)步驟7。 8. 12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。 9. 將吸附柱置于一個(gè)新的離心管（自備）中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000 rpm 離心1分鐘，收集DNA溶液，-20?C保存DNA。 注意： 1）如果下游實(shí)驗(yàn)對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7.0時(shí)洗脫效率不高。 2）Buffer GE在65-70?C水浴預(yù)熱，離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產(chǎn)量；用另外的50-200 μl BufferGE或滅菌水再次洗脫可以增加產(chǎn)量。 3）如果要提高DNA的終濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm離心1分鐘；若洗脫體積小于200 μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產(chǎn)量。如果DNA的量小于1 μg，推薦用50 μl Buffer GE或滅菌水洗脫。 4）因?yàn)楸４嬖谒械腄NA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20?C保存。 動物組織基因組提取 1. 材料處理：如果提取材料為動物組織，取25 mg（脾組織用量應(yīng)少于10 mg）；如果材料為鼠尾，取一段長度為0.4-0.6 cm的大鼠鼠尾或兩段長度為0.4-0.6 cm的小鼠鼠尾。 a. 樣本進(jìn)行液氮研磨或切成小塊后置于1.5 ml離心管中，加入180 μl Buffer GTL，將不同樣品做好標(biāo)記。 b. 若使用勻漿器處理樣本，勻漿前向樣本中加入不超過80 μl Buffer GTL，勻漿后加入100 μl Buffer GTL。 注意：1）確保各組織的量不要超出推薦范圍。2）組織樣本在加入Buffer GTL之前用液氮研磨或加入Buffer GTL用勻漿器勻漿處理，可以增加裂解效率。 2. 加入20 μl Proteinase K，渦旋震蕩使樣品徹底混勻。56?C水浴，直至組織完全裂解，孵育過程中可每隔一段時(shí)間顛倒或震蕩離心管使樣品分散。 注意：1）不同組織消化時(shí)間不同，通常1-3小時(shí)即可完成，鼠尾需要消化6-8小時(shí)，必要時(shí)過夜消化，不會影響后續(xù)操作。2）如果孵育和渦旋震蕩后仍然有膠狀物質(zhì)，延長56?C孵育時(shí)間或再加入20 μl Proteinase K消化。3）如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入4μl的濃度為100mg/ml的RNase A溶液，渦旋15秒，室溫放置5-10分鐘。 3. 加入200 μl Buffer GL，渦旋震蕩充分混勻，70?C水浴10分鐘。短暫離心后加入200 μl無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻。 注意：1）加入Buffer GL和無水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。2）加入Buffer GL和無水乙醇后可能會產(chǎn)生白色沉淀，不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。一些組織（如脾，肺）在加入Buffer GL和無水乙醇后可能形成溶膠狀產(chǎn)物，此時(shí)推薦進(jìn)行劇烈震蕩或渦旋處理。 4. 短暫離心，將步驟3所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm（約13,400xg ）離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 6. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm。離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 注意：如需進(jìn)一步提高DNA純度，可重復(fù)步驟6。 7. 12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切，PCR等）。 8. 將吸附柱置于一個(gè)新的離心管（自備）中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200 μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。 注意：1）如果下游實(shí)驗(yàn)對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7.0時(shí)洗脫效率不高。2）Buffer GE在65-70°C水浴預(yù)熱，離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產(chǎn)量；用另外的50-200 μl BufferGE或滅菌水再次洗脫可以增加產(chǎn)量。3）如果要提高DNA的終濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm離心1分鐘；若洗脫體積小于200 μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產(chǎn)量。如果DNA的量小于1 μg，推薦用50 μl Buffer GE或滅菌水洗脫。4）因?yàn)楸４嬖谒械腄NA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20°C保存。 細(xì)菌基因組提取 1. 細(xì)菌樣本預(yù)處理 1a. 革蘭氏陰性菌 （1）取細(xì)菌培養(yǎng)物1-5 ml（106-108個(gè)細(xì)胞，最多不超過2×109個(gè)細(xì)胞）置于離心管（自備）中，12,000 rpm（~13,400xg）離心1分鐘，盡量吸凈上清。 （2）向沉淀中加入180 μl Buffer GTL，振蕩使菌體重懸。 （3）加入20 μl Proteinase K，渦旋混勻，56°C孵育，直至菌體完全裂解，孵育過程中每隔一段時(shí)間顛倒或震蕩離心管使樣本分散。 注意：如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入4 μl濃度為100 mg/ml 的RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。 （4）加入200 μl Buffer GL，渦旋震蕩混勻。 1b. 革蘭氏陽性菌 （1）取細(xì)菌培養(yǎng)物1-5 ml（106-108個(gè)細(xì)胞，最多不超過2×109個(gè)細(xì)胞）置于離心管（自備）中，12,000 rpm離心1分鐘，盡量吸凈上清。 （2）加入180 μl Enzymatic Lysis Buffer（自備）使菌體重懸。 （3）37°C孵育30分鐘。 （4）加入20 μl Proteinase K渦旋震蕩，充分混勻。加入200 μl Buffer GL，渦旋震蕩混勻。56℃孵育30分鐘。 注意：1）如果需要，95°C孵育15分鐘可以使病原體失活，但是95°C孵育會造成一些DNA的降解。2）如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入4 μl濃度為100 mg/ml 的RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。 2. 加入200 μl無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻。 注意：加入無水乙醇后可能會產(chǎn)生白色沉淀，不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3. 將步驟2所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已裝入收集管的吸附柱（SpinColumns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 4. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 注意：如需進(jìn)一步提高DNA純度，可重復(fù)步驟5。 6. 12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。 注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。 7. 將吸附柱置于一個(gè)新的離心管（自備）中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200 μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20°C保存DNA。 注意： 1）如果下游實(shí)驗(yàn)對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7.0時(shí)洗脫效率不高。 2）Buffer GE在65-70°C水浴預(yù)熱，離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產(chǎn)量；用另外的50-200 μl Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產(chǎn)量。 3）如果要提高DNA的終濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm離心1分鐘；若洗脫體積小于200 μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產(chǎn)量。如果DNA的量小于1 μg，推薦用50 μl Buffer GE或滅菌水洗脫。 4）因?yàn)楸４嬖谒械腄NA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20℃保存。 |
