| 產(chǎn)品編號(hào) | C8001 |
| 英文名稱 | Phalloidin/AbFluor? 488 (Green) |
| 中文名稱 | AbFluor? 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（微絲綠色熒光探針） |
| 別 名 | Phalloidin AbFluor? 488-Conjugated; Phalloidin/AF488; 鬼筆環(huán)肽AbFluor? 488偶聯(lián)物; 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（綠色）; |
| 克 隆 號(hào) | |
| CAS | |
| 理論分子量 | kDa |
| 檢測(cè)分子量 | |
| 保存條件 | -20℃干燥、避光保存，一年有效。 |
| 注意事項(xiàng) | This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications. |
| 產(chǎn)品介紹 |
產(chǎn)品描述： 鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin，而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白G-actin結(jié)合，通常用來標(biāo)記組織切片，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系中的F-actin，從而對(duì)F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動(dòng)植物來源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合，且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動(dòng)蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。 鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1μg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。 本品為AbFluor 488標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對(duì)比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性；且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。 工作液配制： 本品為 20μM 儲(chǔ)存液，300T總量為 300μL。按照 100 nM 的工作液濃度來換算，可制備總量為 60 mL 的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量分裝保存，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。 實(shí)驗(yàn)前，用1×PBS稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦稀釋比例為：1：40-1：200，一個(gè)單位（T）相當(dāng)于200ul總?cè)旧w積中加入1-5ul儲(chǔ)存液，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。最佳稀釋比例可以根據(jù)實(shí)際染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。 染色步驟： 1. 細(xì)胞爬片生長(zhǎng) 24h，使其密度達(dá)到 50%匯合度。 2. 吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞 2 次。 3. 使用4%甲醛PBS溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，冰上固定 10min。 注：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。 4. 室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10min。 5. 室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理10min。 6. 室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10min。 7. 取 200μl 配制好的 AbFluor 488 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育 20min（通常情況下，4℃~37℃ 孵育皆可）。 注：為了降低背景，可于 AbFluor 488 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入 1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。 8. 用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5min。 9. 用 200μl DAPI 溶液（濃度：100 nM）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約 30s。 10. 用 PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做 F-actin 染色分析。 注：也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑合并步驟 9. 10。 11. 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，AbFluor 488（Ex/Em=495/519nm），DAPI（Ex/Em=364/454nm）。 注意事項(xiàng)： 1. 鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對(duì)人的半數(shù)致死劑量 LD50 約 2mg/kg）。 2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 |
