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發(fā)表者：北京博奧森生物      發(fā)表時間：2019-3-25

要想成為流式細胞術(shù)大神

既要了解流式細胞術(shù)的原理

又要懂得熒光素的選擇

最重要的是

讀 懂 流 式 圖！

流式圖有單參數(shù)直方圖、二維散點圖、二維等高線圖與密度圖，三維圖以及假三維圖，其中最常用的是二維散點圖和單參數(shù)直方圖。本文主要對二維散點圖、單參數(shù)直方圖及一些常見問題進行介紹。

1.二維散點圖

二維散點圖能夠表示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系，橫坐標和縱坐標分別代表與細胞有關(guān)的兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示具有相應(yīng)坐標值的細胞。散點圖是一種雙變量描述，可被分為四象限，至少產(chǎn)生四種可能的結(jié)果來明確區(qū)分陰性和陽性。其結(jié)果用整個散點圖中出現(xiàn)的特定象限的細胞占全部細胞的百分率表示，每個點表示一個單獨事件。這四個象限分別用LL，UL，UR，LR表示。

圖1：CD4/FITC(BF00201)、CD8/APC-Cy7（BF00321）雙染

看圖技巧：

LL（左下）：表示對于X軸所代表的參數(shù)呈陰性，對于Y軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細胞，如圖表示CD8、CD4雙陰性細胞。

UL（左上）：表示對于Y軸所代表的的參數(shù)呈陽性，對于X軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細胞，如圖表示CD8+、CD4-細胞。

UR（右上）：表示對于X軸、Y軸所代表的參數(shù)呈雙陽性的細胞，如圖表示CD8+、CD4+雙陽性細胞。

LR（右下）：表示對于X軸所代表的參數(shù)呈陽性反應(yīng)，而對Y軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細胞，如圖表示CD8-、CD4+細胞。

大神支招：必須先了解X軸、Y軸各自所代表參數(shù)的意義；再看四個象限，并了解各象限意義；數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，檢測目的物一般用各象限區(qū)內(nèi)的細胞數(shù)占門內(nèi)細胞數(shù)百分比或平均熒光強度表示 。

2.單參數(shù)直方圖

單參數(shù)直方圖是一維數(shù)據(jù)用的最多的圖形顯示形式，即可用于定性分析，又可用于定量分析。每一個細胞單參數(shù)的測量數(shù)據(jù)可以整理成統(tǒng)計分布，以直方圖的方式來顯示。在圖中，橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，其單位是道數(shù)（channel），可以是線形（line）或者對數(shù)（log）?？v坐標一般是相對細胞/粒子數(shù)（count）。利用直方圖來設(shè)門分析，可得到細胞數(shù)目（events）、門內(nèi)細胞百分比（%gated）、平均熒光強度（mean）、中位數(shù)（median）等統(tǒng)計參量，總的來說單參數(shù)直方圖只能表示具有同一特征細胞的數(shù)量及其熒光強度。

圖2：左為細胞周期（BA00205）分析；右為CD4/FITC(BF00201)表達情況

看圖技巧：先看橫縱坐標了解檢測目的，縱坐標代表細胞數(shù)(如圖細胞周期分析（BA00205）；G1表示細胞進行大量遺傳物質(zhì)合成的時期，G2表示DNA復制結(jié)束和開始有絲分裂之間的間隙，圖右為CD4/FITC(BF00201)的蛋白表達情況)；看圖形分布，直方圖峰型越往右移，代表其熒光強度越強。（右圖中M2區(qū)域細胞的熒光強度要高于M1區(qū)域細胞的熒光強度）；M1的確定是根據(jù)陰性對照細胞的基礎(chǔ)熒光閾值設(shè)定的，峰型右移熒光信號大于基礎(chǔ)熒光閾值M1，表示陽性M2。

Q&A

Q1:流式圖中的顏色與熒光顏色是否一致?

A：與熒光顏色無關(guān)，流式圖中的顏色為人為指定。

Q2：流式圖中的陰/陽（N/P）如何劃分?

A：實際上這個M1的劃分完全是根據(jù)陰性(同型)對照來的，即使用同型抗體進行平行實驗，反映待測標本對抗體非特異性結(jié)合的水平，以幫助省去繁瑣的競爭封閉步驟。右圖即陽性組，也就是接受刺激后的蛋白表達情況。

Q3: 這么巧，陰性正好在10¹劃分？

A：其實我們可以人為地將電壓、放大倍數(shù)調(diào)到相應(yīng)的大小，使陰性的右邊界在某一個值上，（通常劃在10¹附近）這樣后期做sample時好看，當然也可以調(diào)到10²，10³次方。

Q4：為什么要進行熒光補償？

A：流式細胞分析中經(jīng)常要用到2種以上的熒光標記抗體進行染色，而目前所使用的多種熒光染料發(fā)射譜間有一定重疊?！盁晒庋a償”這個術(shù)語是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器除去匹配熒光以外的任何熒光信號。

Bioss 流式細胞技術(shù)服務(wù)

本服務(wù)項目是利用流式細胞儀和熒光標記抗體對客戶提供的細胞樣品或全血樣品進行檢測分析。

可檢測項目：

1、細胞周期檢測：包括細胞培養(yǎng)，細胞周期同步化，細胞進行加藥處理，細胞收集乙醇固定，PI染色上機樣本制備，流式上機檢測，數(shù)據(jù)分析。

2、細胞凋亡檢測：包括細胞培養(yǎng)，細胞進行加藥誘導處理，細胞收集樣本制備，流式上機檢測，數(shù)據(jù)分析。

3、免疫細胞分型：包括細胞收集樣本制備，流式上機檢測，數(shù)據(jù)分析。

4、細胞表面抗原鑒定：包括細胞收集樣本制備，流式上機檢測，數(shù)據(jù)分析。

5、同城上機檢測：由客戶制備好樣本，流式上機檢測，數(shù)據(jù)分析。

服務(wù)編號	服務(wù)項目	實驗周期
SV1401	細胞周期檢測	3-5天
SV1402	細胞凋亡檢測	3-5天
SV1403	免疫細胞分型	2-3天
SV1404	表面抗原鑒定	2-3天
SV1405	同城上機檢測	1-2天

Bioss 檢測案例

八色小鼠脾臟免疫表型分析

1）在FSC/SSC圖上，設(shè)門P1圈出淋巴細胞；基于淋巴細胞在FSC-H/FSC-A圖上設(shè)門E2圈出單個細胞排除粘連體；基于E2在7-AAD/SSC圖上設(shè)門R3圈出7-AAD陰性的活細胞。

2）基于R3門，在CD3/CD19圖上設(shè)十字門，CD3+CD19-為T細胞，CD3-CD19+為B細胞。

3）基于R3門，在CD3/NK1.1圖上設(shè)十字門，CD3-NK1.1+為NK細胞，CD3+NK1.1+為NKT細胞。

4）基于CD3+T細胞，在CD4/CD8a上設(shè)十字門，CD4+CD8-為輔助性T細胞，CD4-CD8+為細胞毒性T細胞。

5）基于CD3+T細胞，在CD8a/CD103和CD25/CD4圖上分析CD103、CD25的表達情況。

圖3：八色小鼠脾臟免疫表型分析

經(jīng)典雙激光六色熒光搭配方案