熒光分子可以說是生物學研究中最經常使用的標記分子，它們作為探針標記目標分子，可用于監(jiān)測其表達量及示蹤。它們相對于放射性同位素更加安全和環(huán)保，相對于不發(fā)光的標記物如HRP或金屬顆粒等更加靈敏。因而應用非常廣泛。下面我們將從熒光的發(fā)光原理開始，簡單介紹免疫熒光（IF）和流式細胞術（FCM）的應用。
光是一種可見的電磁波，是能量的輻射形式。光的波長越長，光子的能量越小。
光進入某物質后，部分或全部的光能可被物質的分子或原子所吸收。光的吸收具有選擇性，一定能量的光量子輻射只能被一定結構的物質吸收。
熒光的基礎知識：熒光是物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。
熒光物質的種類：芳香族及雜環(huán)化合物、熒光蛋白、納米顆粒（量子點）。
熒光物質發(fā)光原理：光照射到某些原子時，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，瞬間將恢復基態(tài)，當電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復到基態(tài)時，能量會以光的形式釋放，產生熒光。
能級躍遷
每一種熒光物質都有其特定的激發(fā)光譜（Excitation）和發(fā)射光譜（Emission）。通常以相對強度為縱軸，以波長為橫軸，這些吸收光譜和發(fā)射光譜有很好的對應關系。激發(fā)光譜是固定發(fā)射光的波長，測量激發(fā)光的波長（有時候也測波數或者頻率等）與熒光強度之間的關系；發(fā)射光譜是固定激發(fā)波的波長，測定發(fā)射光強度與波長的關系。熒光物質的發(fā)射波長總是大于其激發(fā)波長。 兩者的差值即為斯托克斯位移（Stokes shift）。
斯托克斯位移（Stokes shift）
可根據這種熒光素的激發(fā)譜線來確定熒光素適宜的激發(fā)波長，根據其發(fā)射譜來確定熒光素檢測波長。
常見熒光素的激發(fā)及發(fā)射波長
可根據熒光素的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長選擇光源和濾光片。
熒光標記的應用
熒光標記幾乎可以用于所有生物學檢測，作為蛋白或抗體標記物可用于ELISA、IF、FCM、WB，蛋白芯片、及活體成像等，作為核酸標記物可用于FISH、基因芯片、qRT-PCR等。熒光標記幾乎可以用于從宏觀的活體研究到微觀的組織、細胞、分子，甚至分子內、分子間作用的所有生物學研究領域。
熒光標記最常見的生物學應用是免疫熒光（IF）和流式細胞術（FCM）。在免疫熒光中，最常用的是靶點胞內定位、示蹤及活體分子成像等。
常見胞內定位熒光分子
一、細胞器熒光分子：能滲透到細胞內，選擇性地與細胞器結合的熒光物質?？捎糜诩毎鞯娜旧?，例如：
線粒體熒光分子——JC-1, Rhodamine 123
溶酶體熒光分子——DAMP, Neutral Red
內質網熒光分子—— Dioc6(3), Dioc5(3), Dioc16(3)
高爾基體熒光分子——NBD Ceramide, BODIPY Ceramide
二、 細胞骨架熒光分子
F-肌動蛋白熒光分子—— BONIPY FL, BONIPY 558/568
G-肌動蛋白熒光分子——DNase I+熒光素（Alexa Fluor 488、Oregon Green 488、Texas Red）
微管蛋白熒光分子——秋水仙減+熒光素、DAPI、DCVJ、Bis-ANS
微管選擇性紫杉醇分子——Flutax-2、BODIPY FL Placlitaxel、BODIPY 564/570 、Placlitaxel
三、研究鈣調節(jié)和活性的熒光分子
鈣調蛋白熒光分子——鈣的類似物三氯化忒
PKC熒光分子——用BODIPY標記的佛波酯或乙酰輔酶A熒光探針
鈣離子熒光分子——Quin-2-AM、Fura-2-AM、Fura-3-AM
四、核酸熒光分子：能以非共價鍵與DNA/RNA結合，用于DNA/RNA的定性、定量分析。
胞膜透過性核酸熒光分子——用于細胞染色（SYTO、AO、Hoechst、DAPI）
非透過性核酸熒光分子——用于DNA瓊脂凝膠電泳（EB和PI、PO-PRO和BO-PRO、AAD、ACMA）
熒光應用舉例
一、共定位實驗
共定位研究其實是利用不同熒光標記不同的細胞器或亞細胞單位，于是在熒光顯微鏡下，細胞呈現出絢爛的胞內分區(qū)，當標記了熒光的興趣分子進入細胞后，便可輕松看到其在胞內的定位并可研究其運動軌跡。
案例Ⅰ 利用特定熒光蛋白分別標記過氧化物酶體（Peroxisome）、質膜（PM）和線粒體（Mitochondria），當幾張熒光照片疊加（merge）在一起時，就出現了絢爛的細胞分區(qū)；
案例Ⅱ 利用綠色、紅色和藍色熒光物質分別對肌動蛋白（actin）、波形蛋白（vimentin）和DNA染色后，即可呈現Hela細胞細胞骨架、中間絲和細胞核區(qū)；
案例Ⅲ 再如，利用紅色的線粒體熒光素（MitoTracker Red CMXRos）、綠色熒光素連接鬼筆環(huán)肽（phalloidin）及藍色的DAPI，CV-1細胞的線粒體、微管及核區(qū)變得層次分明。
二、體外示蹤
利用熒光進行實時胞內分子示蹤，是細胞動態(tài)研究的一個重要方法。
案例Ⅰ 利用特定熒光蛋白分別標記過氧化物酶體（Peroxisome）、質膜（PM）和線粒體（Mitochondria），當幾張熒光照片疊加（merge）在一起時，就出現了絢爛的細胞分區(qū)；
案例Ⅱ 2018年Cell的這篇報道，更是將活細胞的熒光示蹤技術發(fā)揮到了極致?？茖W家團隊利用熒光示蹤技術，展示了移植的鼠胚胎從單細胞到各胚層形成的全程，展示了各個細胞的發(fā)育過程，甚至心臟組織最初的跳動，amazing~
Katie McDole et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. (2018) Cell. Oct 18; 175(3): 859-876.e33.
案例Ⅲ Wang等報道了綠色熒光標記組蛋白（γ-H2AX）后，當細胞經過重金屬氧化物處理，細胞發(fā)生了DNA斷裂（綠色熒光增高）的動態(tài)過程，并通過pH敏感的橙色熒光素吖啶橙（AO），展示了經處理細胞的溶酶體膜通透性增加，細胞凋亡程度增加。
Histone γ-H2AX用于展示DNA雙鏈的斷裂
AO用于展示lysosome的膜不穩(wěn)定性
Wang Z, et al. Biomimetic nanoflowers by self-assembly of nanozymes to induce intracellular oxidative damage against hypoxic tumors.(2018) Nat Commun. Aug 20;9(1):3334.Rabbit anti-Phospho-Histone H2AX (catalog: bs-3185R, 1:200) was purchased from Bioss.
案例Ⅳ 研究細胞凋亡的一個經典方法是Annexin-V和PI的雙熒光標記，利用流式細胞儀可對細胞群凋亡進行定量化研究。Zeng等利用這個方法研究了微小RNA（microRNA-211）對小鼠晶狀體上皮細胞所造成的凋亡影響。
Kun Zeng, et al. Effects of microRNA-211 on proliferation and apoptosis of lens epithelial cells by targeting SIRT1 gene in diabetic cataract mice.(2017)Bioscience Reports 37.Rabbit anti-mouse polyclonal antibody SIRT1 (bs-0921R, 1:500), Bcl-2 (bs-20351R), p53 (bs-8687R) were purchased from Bioss.
案例Ⅴ 利用流式細胞術還可以分析細胞或囊泡內成分的變化。例如利用熒光標記脂肪細胞的Shh蛋白，可發(fā)現胰島素耐受病人的脂肪細胞所分泌的外泌體（exosomes）中，Shh蛋白含量高于正常人脂肪細胞的外泌體。
Song M, et al., Adipocyte-Derived Exosomes Carrying Sonic Hedgehog Mediate M1 Macrophage Polarization-Induced Insulin Resistance via Ptch and PI3K Pathways. (2018) Cell Physiol Biochem. 48(4):1416-1432.Antibodies for ADE flow cytometry analysis were purchased from Bioss (Adiponectin-PE, bs-0471R and Shh-FITC, bs-1544R) .
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