化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)簡介
一、 免疫學(xué)檢測發(fā)展階段
免疫學(xué)檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對檢測信號進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。我國免疫學(xué)的檢測基本歷經(jīng)了以下幾個過程，如圖1.1 所示。
盡管免疫診斷在臨床診斷中占據(jù)著非常重要的地位，但是從我國臨床免疫診斷現(xiàn)狀來看，無論是臨床應(yīng)用方面，還是產(chǎn)業(yè)化角度，都處于相對比較落后的狀態(tài)，亟待改進(jìn)。下表１.１就此做一比較：
表 1.1 中國免疫診斷現(xiàn)狀
二、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)及其優(yōu)勢
【概述】
本世紀(jì) 70 年代中期Arakawe 首次報道用發(fā)光信號進(jìn)行酶免疫分析，利用發(fā)光的化學(xué)反應(yīng)分析超微量物質(zhì)，特別是用于臨床免疫分析中檢驗超微量活性物質(zhì)。目前，這一技術(shù)已從實驗室的稀有技術(shù)過渡到臨床醫(yī)學(xué)的常規(guī)檢測手段?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)。其檢測原理與放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似，不同這處是以發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素或酶作為標(biāo)記物，并藉助其自身的發(fā)光強度直接進(jìn)行測定。
化學(xué)發(fā)光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫的操作簡便、快速的特點，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保持期長，應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和臨床實驗診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
【原理】
在化學(xué)發(fā)光免疫分析中包含兩個部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)，其基本原理同酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA），常采用雙抗體夾心法、競爭法、間接法等反應(yīng)模式，如圖1.2，1.3，1.4 所示。
圖 1.2 雙抗體夾心反應(yīng)原理示意圖
圖 1.4 競爭法（阻斷法）反應(yīng)原理示意圖
化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的原理在于免疫反應(yīng)中的酶作用于發(fā)光底物。發(fā)光底物在酶的作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時，可同時發(fā)射出光子。利用發(fā)光信號測量儀器即可測量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測物質(zhì)的量成正比。由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品中待測物質(zhì)的含量。
（1）與放免（RIA）產(chǎn)品比較
與放射免疫試劑（RIA）比較，化學(xué)發(fā)光避免了放射性核素的污染以及對操作人員的傷害，大大縮短了反應(yīng)時間，同時兼具高靈敏度的優(yōu)勢。
（2）與酶免（ELISA）產(chǎn)品比較
靈敏度與可測范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶免產(chǎn)品，兼具ELISA 法簡便的操作方法與較短的反應(yīng)時間。
三、化學(xué)發(fā)光常用的化學(xué)試劑及其原理
化學(xué)發(fā)光是某種物質(zhì)分子吸收化學(xué)能而產(chǎn)生的光輻射。任何一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都包括兩個關(guān)鍵步驟，即化學(xué)激發(fā)和發(fā)光。因此，一個化學(xué)反應(yīng)要成為發(fā)光反應(yīng)，必須滿足兩個條件：第一：反應(yīng)必須提供足夠的能量（ 170 ~300KJ/mol ） ，第二，這些化學(xué)能必須能被某種物質(zhì)分子吸收而產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)，并且有足夠的熒光量子產(chǎn)率。到目前為止，所研究的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)大多為氧化還原反應(yīng)，且多為液相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率是指發(fā)光劑在反應(yīng)中的發(fā)光分于數(shù)與參加反應(yīng)的分子數(shù)之比。對于一般化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，值約為 10-6，較典型的發(fā)光劑，如魯米諾，發(fā)光效率可達(dá)0.01 ，發(fā)光效率大于 0.01 的發(fā)光反應(yīng)極少見?，F(xiàn)將幾種發(fā)光效率較高的常用的發(fā)光劑及其發(fā)光機理歸納如下。
1. 魯米諾及其衍生物
魯米諾的衍生物主要有異魯米諾、 4-氨基已基-N-乙基異魯諾及 AHEI 和 ABEI 等。魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，輻射出最大發(fā)射波長為 425nm 的化學(xué)發(fā)光。
在通常情況下魯米諾與過氧化氫的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相當(dāng)緩慢，但當(dāng)有某些催化劑存在時反應(yīng)非常迅速。最常用催化劑是金屬離子，在很大濃度范圍內(nèi)，金屬離子濃度與發(fā)光強度成正比，從而可進(jìn)行某些金屬離子的化學(xué)發(fā)光分析，利用這一反應(yīng)可以分析那些含有金屬離子的有機化合物，達(dá)到很高的靈敏度。其次是利用有機化合物對魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的抑制作用，測定對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)具有猝滅作用的有機化合物。其三是通過偶合反應(yīng)間接測定無機或有機化合物。其四是將魯米諾的衍生物如異魯米諾 (ABEI) 標(biāo)記到羧酸和氨類化合物上，經(jīng)過高效液相色譜 (HPLC) 或液相色譜 (LC) 分離后，再在堿性條件下與過氧化氫－鐵氰化鉀反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。也可以采用其它分離方法，如將新合成的化學(xué)發(fā)光試劑異硫氰酸異魯米諾標(biāo)記到酵母 RNA 后，通過離心和透析分離，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。此外應(yīng)用的還有 N 2(B2 羧基丙?；?) 異魯米諾，并對其性能進(jìn)行了研究。
2. 光澤精
光澤精以硝酸鹽的形式存在，在堿性介質(zhì)中，過氧化氫將其氧化成四元環(huán)過氧化物中間體，而后裂解生成激發(fā)態(tài)的吡啶酮而發(fā)光。利用光澤精與還原劑作用，可用于測定臨床醫(yī)學(xué)上一些重要的還原性物質(zhì)，如抗壞血酸、肌酸酐、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、乳糖、葡萄糖。
3. 洛粉堿
洛粉是文獻(xiàn)上記載最早的化學(xué)發(fā)光試劑，但卻遲遲未得到應(yīng)用，直到 1979 年 Marino 等人將它應(yīng)用于 Co 的測定后才得到重視。此試劑已被用于多種元素的分析測定。
4. 過氧化草酸酯類
草酸鹽類化學(xué)發(fā)光反應(yīng)大都生成過氧草酰 (Peroxalate) 中間體，因此這類反應(yīng)亦稱過氧草酰類化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。過氧草酸鹽類化學(xué)發(fā)光分析應(yīng)用的推廣還有賴于新的熒光衍生試劑的開發(fā)。
5. 吖啶酯類
McCap等合成了一系列吖啶酯類化合物，對該類試劑的化學(xué)發(fā)光機理研究表明，發(fā)光效率與試劑中的可解離酸性基團的pKa有密切關(guān)系,pKa一般應(yīng)小于11 。吖啶酯類化合物是一類很有前途的非放射性核酸探針標(biāo)記物，用作 DNA 的發(fā)光探針，發(fā)光量子產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好，標(biāo)記物對雜交反應(yīng)的動力學(xué)和雜交體的穩(wěn)定性無影響，可以直接在堿性介質(zhì)中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
以上五種化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率高，水溶液穩(wěn)定，能被多種氧化劑直接氧化而發(fā)光，也可被眾多的金屬高于催化發(fā)光反應(yīng)而發(fā)光，許多無機、有機和生化組分也能增強或抑制其發(fā)光，因此應(yīng)用十分廣泛。目前報道的有鄰菲咯啉，堿基水楊酸、羅明丹 —B 、沒食子酸、香豆素、皮素，茜素紫、蘇木色精，培花青，三苯甲烷類染料，丙酮、乙醇、羥胺等。這些試劑商品化程度高，價廉，使用方便，但化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率較低，因此，研究增敏試劑來提高它們的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率是非常關(guān)鍵的。
四、化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用
1. 無機化合物化學(xué)發(fā)光分析
1.1 金屬離子分析
痕量金屬離子對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)具有很好的催化作用，因而化學(xué)發(fā)光測定金屬離子得到廣泛的應(yīng)用。但是，由于不同金屬離子催化氧化發(fā)光試劑時，發(fā)光光譜相同，致使金屬離子催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的選擇性較差。為提高分析的選擇性，可采用以下方法 : (1) 利用待測金屬離子與干擾離子配合物穩(wěn)定性不同進(jìn)行選擇性分析，如加入掩蔽劑 EDTA 或水楊酸掩蔽干擾離子 ; (2) 優(yōu)化實驗條件以減少其它離子的干擾 ; (3) 稀釋樣品溶液 ;(4) 加入敏化劑。但是，當(dāng)樣品中待測物相對于干擾物濃度很小時，上述方法也無濟于事，只得進(jìn)行前處理，常用的分離方法有色譜、溶劑萃取等。
色譜分離的高選擇性與化學(xué)發(fā)光檢測的高靈敏度相結(jié)合，是一種很有前途的聯(lián)用技術(shù)。關(guān)鍵是流動相的選擇，流動相選擇得好，不僅可以提高選擇性，還可以進(jìn)行多個離子的同時測定。如用離子交換分離法同時測定 Cr (à ) 和 Cr (? ) 。溶劑萃取也是提高化學(xué)發(fā)光測定金屬離子選擇性的一個有效方法。這種方法的主要問題是費時，因為進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測前必須將無機物從有機溶劑中反萃取出來，或是將有機溶劑蒸發(fā)除去。較好的方法是自動在線溶劑萃取選擇性檢測待測物。
1.2 其它無機化合物的分析
化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，過氧化氫是最常用的一種氧化劑，因此有關(guān) H 2 O 2 化學(xué)發(fā)光分析的報道較多，涉及到魯米諾、過氧草酸酯及光澤精等化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。根據(jù)魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)制成的 H2O2 光纖傳感器與流動注射法聯(lián)用，可檢測 10nmo l /L~1 mmo/L 的 H2O2 ，用模擬酶代替辣根過氧化物酶催化魯米諾發(fā)光，檢測限可達(dá) 5 . 5×10 - 9 mo l /L 。根據(jù) ClO - 對魯米諾的氧化作用，可用于測定 ClO - ，其它物質(zhì)如 Cl 2 的干擾，可用流動注射法消除。利用停流技術(shù)測定水中 ClO - 不必進(jìn)行前處理。含氮的無機化合物如 NH3/NH +4 ，可將其衍生后用 TCPO 化學(xué)發(fā)光法檢測，線性范圍為 2.9ug /L ~6 m g /L 。 CN － 能抑制魯米諾 H 2 O 2 － Cu (II ) 的化學(xué)發(fā)光，據(jù)此可分析測定 CN — 。在低溫條件下化學(xué)發(fā)光分析測定 CN － ，當(dāng)進(jìn)樣量為 100uL 時，線性范圍為 10-9－ 10 -7 g ／ mL ，當(dāng)進(jìn)樣量 20 uL 時，線性范圍為 10-8 ～ 5×10 -7 g ／ mL 。
2. 有機化合物的化學(xué)發(fā)光分析
2.1 有機酸
有機化合物的同系物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，使單一組分的測定遇到困難，因此有機化合物同系物的分析常與 HPLC 相結(jié)合。有機酸的化學(xué)發(fā)光分析 ，一般是先將其衍生成熒光物質(zhì)經(jīng)色譜分離后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。但衍生法有如下的缺點 : (1) 衍生反應(yīng)不完全 ; (2) 衍生物穩(wěn)定性差，要求及時檢測 ; (3) 限制了分離方法和條件的選擇。由于衍生產(chǎn)物的性質(zhì)與待測物不同，導(dǎo)致分離效率和分辨率下降，同時增加分析的時間和勞動強度。在臨床醫(yī)學(xué)上，草酸是一個重要的檢測項目，可以直接用氧化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)測定尿液和草酸二乙酯中的草酸鹽及游離的草酸。另外還可以測定苯酮尿癥病人的尿液的苯丙酮酸的含量，方法是先在堿性條件下將苯丙酮酸氧化成 1,22 二氧雜環(huán)丁烷類化合物，然后裂解產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。另外可以將 Fe （ III ）草酸配合物光解得到 Fe (II ) ，催化魯米諾－過氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，此法線性范圍為0.1～ 100uM 。此外酶聯(lián)偶合反應(yīng)也可以用于某些有機酸的化學(xué)發(fā)光分析。
2.2 有機堿
胺類化合物第一離子化電勢呈如下規(guī)律 : 伯胺 > 仲胺 > 叔胺，并隨碳鏈增長，離子化電勢逐漸下降，因此叔胺化合物的檢測限較低，達(dá) 0 . 28 pM 。胺類化合物的分析，較多的是經(jīng)柱前衍生生成熒光衍生物，分離后用過氧草酸鹽化學(xué)發(fā)光體系檢測，也可將其生成希夫堿或其它產(chǎn)物氧化而發(fā)光。有些堿如腎上腺素等可直接氧化而發(fā)光。通常有一個經(jīng)驗規(guī)則，假如一物質(zhì)具有熒光或其反應(yīng)產(chǎn)物有熒光，該物質(zhì)一般可發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，但也有例外。嘌呤堿是核酸的基礎(chǔ)物質(zhì)，因此對嘌呤堿的分析測定將推動 DNA 分析方法的發(fā)展。在酸性醇液中腺嘌呤與苯甲醛反應(yīng)，然后用過氧化氫氧化反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，此法具有很好的選擇性，線性范圍為 1 . 5×10-7～ 5 . 0×10-7M ，用此法測定鳥嘌呤靈敏度比熒光法高 20 倍。
2.3 氨基酸
氨基酸分析方法的改進(jìn)有利于推動生物技術(shù)、基因工程、 DNA 重組和基因克隆等的發(fā)展。由于絕大多數(shù)氨基酸沒有內(nèi)源熒光特性，因此用過氧草酸鹽體系測定氨基酸需將其衍生成熒光物質(zhì)，但此法避免不了衍生法所固有的缺點。此外亦可通過測定氨基酸與氨基酸氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫來測定氨基酸的含量，如 L 2 氨基酸經(jīng)反相色譜柱分離后流經(jīng) L 2 氨基酸氧化酶反應(yīng)器產(chǎn)生過氧化氫，然后用過氧草酸鹽體系檢測。氨基酸與 Ru (b ipy) 3+3 反應(yīng)，用流動注射化學(xué)發(fā)光法檢測，相對于脯氨酸和天冬酰胺檢測限可分別達(dá)到 20 pmo l 和 50 pmo l 。一般來說，仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的的發(fā)光強度比伯胺大。對氨基酸上取代基性質(zhì)研究表明，給電子基有利于增強化學(xué)發(fā)光強度。
2.4 糖類
光澤精體系可用于測定一些還原性物質(zhì)，如乳糖、葡萄糖，用于抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的分析測定有很高的靈敏度。但此法用于復(fù)雜樣品分析卻因干擾多而受到限制。用草酰胺化學(xué)發(fā)光照相法測定了葡萄糖。在微量滴定板上將草酰胺發(fā)光劑、熒光增感劑及 50 uL 試樣混合，于 5 m in 內(nèi)用照相熒光劑測定液斑的發(fā)光強度，可檢出 100 pmo l 的萄萄糖。
糖類物質(zhì)測定的另一個重要方法是測定酶反應(yīng)產(chǎn)生的 H2O2 ，由此對酶底物 —— 葡萄糖、乳糖等進(jìn)行測定。而酶的固定化技術(shù)為此法的發(fā)展注入了新的活力。采用物理包埋法將葡萄糖氧化酶固定在聚丙烯酰胺凝膠中并制成酶柱，再將酶柱接入流動注射系統(tǒng)中，用流動注射化學(xué)發(fā)光法測定由酶促反應(yīng)產(chǎn)生的 H2O2 ，從而測定人體血液中的葡萄糖，檢出限可達(dá) 0.1 m g /L 。
2.5 類固醇與類酯
一些特異性酶如類固醇脫氫酶和其它熒光素酶與合適底物反應(yīng)產(chǎn)生 H2O2 ，通過測定 H2O2 達(dá)到分析測定底物的目的。
2.6 藥物
根據(jù)藥物的不同類型選擇不同的化學(xué)發(fā)光分析方法。目前較常用的方法是直接氧化化學(xué)發(fā)光。在堿性溶液中用 N －溴代丁二酰亞銨氧化含有酰胺基的藥物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，如利福霉素等檢測限在1.23 m g /L~0.5 g/L 之間。氧化四環(huán)素類藥物檢出限在 0 . 02-0 . 04 m g/L 之間。
3. 化學(xué)化光在生物領(lǐng)域的應(yīng)用
化學(xué)發(fā)光在生物學(xué)領(lǐng)域也有著很多應(yīng)用，主要簡介如下：
3.1 Fe 2 +
離子催化的化學(xué)發(fā)光自由基啟動的脂質(zhì)過氧化 (LPO) 是一個鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程。 在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中， Fe 2 + 離子起著啟動和催化的作用。 反應(yīng)過程中產(chǎn)生脂自由基 (R-) 、烷氧自由基 (RO-) 、共軛二烯和脂過氧化自由基 (ROO-) 等中間產(chǎn)物。 ROO-自反應(yīng)會產(chǎn)生激發(fā)的烷氧自由基 (RO3 ) 和單線態(tài)氧 (O2 ) ，其回到基態(tài)時產(chǎn)生發(fā)光。 另外，兩個 O2 分子相互作用也可產(chǎn)生發(fā)光。 因此，把 Fe 2 + 鹽加入含有脂肪的系統(tǒng)中，如細(xì)胞膜、線粒體、微粒體、血漿、組織勻漿、尿液等，可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 化學(xué)發(fā)光的動力學(xué)曲線，可分為快速閃光期、潛伏期、緩慢發(fā)光期和穩(wěn)定發(fā)光期。有報告提出，快速閃光期的發(fā)光強度與樣品中過氧化氫含量有關(guān)，潛伏期的長短與樣品中抗氧化劑含量有關(guān)，而緩慢發(fā)光期和穩(wěn)定發(fā)光期的發(fā)光強度則反映了系統(tǒng)的過氧化水平，即系統(tǒng)產(chǎn)生活性氧的能力。
3.2 血漿和血清的化學(xué)發(fā)光
許多實驗研究對加入 Fe 2 + 鹽的不同疾病患者血漿和血清的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行的測量表明，與正常健康人相比，腹腔器官局部缺血、肢端閉合性局部缺血、血氧含量下降以及出血、手術(shù)性休克病人血漿和血清的發(fā)光強度降低。 與此相反，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、闌尾炎、膽囊炎、胰腺炎等炎性疾病患者血漿和血清的發(fā)光強度升高。 降低和升高的幅度與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。 有研究提出，利用此方法有可能對非典型的心肌梗塞和腹腔器官炎性疾病做出區(qū)別診斷。
3.3 血漿脂蛋白的化學(xué)發(fā)光
有研究提出，以分離的血漿脂蛋白懸液作為系統(tǒng)模型可以研究不同物質(zhì)對系統(tǒng)過氧化的調(diào)節(jié)機制。在分離的血漿脂蛋白懸液中加入膽固醇，溫育一定時間后在加入 Fe 2 + 鹽，測量化學(xué)發(fā)光，發(fā)現(xiàn)膽固醇能使系統(tǒng)的發(fā)光強度降低。分析認(rèn)為，這可能是由于類固醇的存在抑制了系統(tǒng)的過氧化。對實驗性膽固醇過多血癥家兔和動脈粥樣硬化早期病人進(jìn)行的測量發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白 APO – B 。在 Fe 2 + 存在條件下的發(fā)光強度出現(xiàn)了增長。同樣的現(xiàn)象在肝硬化和慢性肝炎患者身上也被發(fā)現(xiàn)。
3.4 尿液的化學(xué)發(fā)光
利用尿液的化學(xué)發(fā)光可以研究腎臟功能的變化。將 Fe 2 + 鹽加入尿液中，測量其化學(xué)發(fā)光，發(fā)現(xiàn)腎功能不足者尿液的發(fā)光強度降低。與正常健康人相比，闌尾炎患者尿液的發(fā)光強度則有不同程度的提高。利用這一方法可以評估腎臟的排泄及收縮功能。
3.5 物質(zhì)抗氧化活性的測定
利用發(fā)光測量技術(shù)可以評價某些生物組織和體液的抗氧化活性。以某一穩(wěn)定的發(fā)光系統(tǒng)為模型，如脂肪體、線粒體、卵黃脂蛋白等，將待測的抗氧化物質(zhì)加入該系統(tǒng)，然后加入 Fe 2 + 鹽，測量其化學(xué)發(fā)光。 根據(jù)系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光被抑制的程度可以評價物質(zhì)的抗氧化活性。 利用這一方法進(jìn)行的研究證明，不同疾病患者血漿和血清的抗氧化活性是不同的。
3.6 H2O2 激發(fā)的化學(xué)發(fā)光
3.6.1 血漿和血清的化學(xué)發(fā)光
在血漿和血清中加入 H2O2 溶液后能激發(fā)化學(xué)發(fā)光。有報告提出，發(fā)光強度與血漿中血紅素的水平呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 + 0. 71 。在上述發(fā)光系統(tǒng)中，加入過氧化氫酶或松香油后，發(fā)光被抑制，加入疊氮化鈉 (NaN3 ) 后，發(fā)光幾乎完全消失。 H2O2 激發(fā)的血漿和血清的化學(xué)發(fā)光，其啟動因素很可能是血紅素過氧化物酶催化 H2O2 分解引起的。血紅素過氧化物對 H2O2 的分解是以 H2O2 氧化其底物為前提的。在這一反應(yīng)過程中導(dǎo)致自由基及其中間產(chǎn)物生成，并與機體分子相互作用，產(chǎn)生 O2 等活性物質(zhì)，產(chǎn)生發(fā)光。 NaN3 和松香油是 O2 的抑制劑，所以在上述發(fā)光系統(tǒng)中加入松香油的 NaN 3 后，發(fā)光被抑制。血液中血紅素過氧化物酶等以自由基方式分解 H2O2 ，而過氧化氫酸則以非自由基方式分解 H2O2 ，生物體內(nèi)這兩類反應(yīng)體系協(xié)同作用，能很好的清除細(xì)胞內(nèi)的 H2O2 。病理條件下，這一反應(yīng)體系的平衡被破壞， H2O2 激發(fā)的化學(xué)發(fā)光強度將發(fā)生相應(yīng)改變。因此，根據(jù)血漿和血清化學(xué)發(fā)光的變化，有可能對某些疾病進(jìn)行區(qū)別診斷。
3.6.2 紅細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光
1981 年 Cepгиеко 等人在分離出的紅細(xì)胞懸液中加入 H2O2 溶液，對其化學(xué)發(fā)光進(jìn)行測量。 發(fā)現(xiàn)，隨著紅細(xì)胞的老化和溶解，系統(tǒng)發(fā)光強度呈增長趨勢。隨后對實驗性動脈粥樣硬化家兔紅細(xì)胞化學(xué)發(fā)光進(jìn)行的測量發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，發(fā)光強度出現(xiàn)了降低。這可能是由于細(xì)胞膜中膽固純含量過高造成的。對惡性腫瘤患者的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)發(fā)光強度的改變。紅細(xì)胞的衰老與脂質(zhì)過氧化有關(guān)。 H2O2 能引發(fā)膜脂過氧化， H2O2 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物都能引起血紅蛋白釋放 Fe 2 + ， Fe 2 + 是誘發(fā)一系列自由基反應(yīng)、起動脂質(zhì)過氧化的催化劑。自由基的產(chǎn)生不僅促進(jìn)了紅細(xì)胞的衰老和溶解，而且引發(fā)的脂質(zhì)過氧化還可以導(dǎo)致膜脂組分和結(jié)構(gòu)的改變，直接影響紅細(xì)胞的生理功能。
